干细胞居然是你身体里的抗癌能手（下）： 三个实验验证“永生DNA链假说”

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之前我们介绍了 " 永生 DNA 链假说 "，这是一个非常 " 聪明 " 的减少癌症发生率的方法，可以说保护着我们中的大多数人免得癌症。

在科学探索的历程中，哪些实验验证了这个假说？

非随机才是常态

为了证明干细胞能够保留永生的 DNA 链，Cairns 与 Christopher Potten （1940-2012）合作，用 3H 胸腺嘧啶标记小鼠小肠干细胞形成时的 DNA，4 周后观察这些具有放射性的 DNA 分布情况。结果发现，随着细胞分裂次数的增加，具有放射性的 DNA 由于随机分配而不断 " 稀释 "，导致放射性强度降低。

但是在隐窝（crepts，小肠绒毛之间的凹陷处）深处，从底部往上算起第 4 位上的细胞放射性强度很高，与 DNA 刚被标记时相当。这里正好是小肠干细胞所在的位置，所以很可能是小肠干细胞在一直保留被标记的 DNA 链。用同样的方法， Cairns 与 Potten 在舌头味蕾基部（也是干细胞所在的位置）发现了少数保留放射性 DNA 的细胞。这些结果也都支持了永生 DNA 链的假说。

小肠隐窝纵切片示意图，从下往上数第四个细胞即为小肠干细胞

图片来源：参考文献 14

其他科学家对动物、植物、真菌进行了多次观测，并证实了 Cairns 的观察结果。在这些研究中，细胞都能长时间保留标记的 DNA 链，因而被称之为 " 标记保留细胞 "（Label retaining cells, LRCs）。它们在数量上远少于组织中的其他细胞，而这正是干细胞在各种组织中数量的特点，其位置也符合用其它方法发现的干细胞的位置，与 Cairns 关于干细胞能够选择性地保留永生的 DNA 链的理论相符。这些实验说明DNA 链的非随机分配是一个在生物界中普遍存在的现象。

但是这些结果还不能证明这些细胞就是干细胞。如果在被标记之后有少数细胞出于某种原因不再分裂，这些细胞也能够长期保留被标记的 DNA 链。而干细胞的任务是替补老化和受损的体细胞，是必须进行分裂的，如果能够证明这些保留标记 DNA 链的细胞也在不断分裂，那就可以为这些细胞是干细胞的结论提供更有说服力的证据。

双标记法证明标记保留细胞确实在分裂

2002 年，为了证明小肠绒毛中标记保留细胞确实在分裂，除了用 3H 胸腺嘧啶标记 DNA 链外，Potten 还用 BrdU（溴代脱氧尿苷）标记以含 3H 的 DNA 链（爷爷辈的）为模板合成的 DNA 链（父亲辈的）。在 BrdU 标记后的第一天，90% 以上的小肠绒毛隐窝第 4 位的细胞都被 3H 和 BrdU 同时标记，说明这些细胞在被 3H 标记后进行过细胞分裂（这样 BrdU 才能组入新合成的 DNA 链）。

在往后的日子中，第 4 位的细胞一直保留 3H 标记，而 BrdU 的信号却逐渐下降，到第 8 天时信号强度只余下 3%。如果第 4 位的细胞不分裂，3H 和 BrdU 的信号都应该一道被保留，而如果细胞分裂时 DNA 的分配是随机的，3H 的信号和 BrdU 的信号都应该同时被稀释而不断降低。实际观察结果说明，这些细胞在不断地进行不对称分裂。继续作为干细胞的子细胞保留了被 3H 标记的、辈分较高的 DNA 链，而被 BrdU 标记的父亲辈 DNA 链则被分配到要进行分化的子细胞中去，在其后的对称分裂中逐渐被稀释。这是对小肠干细胞进行不对称分裂，选择性地保留 DNA 链原件最强有力的证据。

此后，科学家们进行了更多次双标记法标记细胞的实验，均表明动物组织中那少数保留 DNA 链原件的细胞确实在不断地进行分裂，进一步支持了这些细胞是干细胞的想法。

用 BrdU 标记的人体心脏细胞 DNA 链所观测到的 DNA 随机分离（A）与非随机分离（B）现象

图片来源：参考文献 15

不过这些实验还没有完全证明保留 DNA 链原件的细胞真的具有干细胞的特征，而继承辈分低的 DNA 链的细胞真的是要进行分化的细胞。随着干细胞研究的进展，这个问题也被解决了。

保留 DNA 链原件的细胞具有干细胞的特征

2007 年，美国斯坦福大学的 Thomas Rando 用氯代脱氧尿苷（CIdU）和碘代脱氧尿苷（IdU）来标记小鼠的肌肉干细胞。干细胞原本的 DNA 是爷爷辈的，不进行标记；其第一轮分裂时形成的 DNA 为父亲辈的，用 CIdU 标记；第二轮分裂时的 DNA 为儿子辈的，用 IdU 标记。标记后的细胞被分开为单个细胞培养，让细胞完成第二轮分裂。

为了更好地追踪细胞第二轮分裂的情形，Rando 在培养基中加入了细胞松弛素（cytochalasin D）。细胞松弛素不影响细胞核的分裂，但能使分裂形成的两个子细胞不会完全分开，而是形成细胞对，这样就可以确保这两个细胞是来自同一个干细胞。染色结果表明，所有的子细胞都含有 IdU 的染色，但是 CIdU 染色只集中在其中的一个子细胞中。由于 CIdU 标记的是父亲辈的 DNA 链，不显示 CIdU 染色的细胞应该就是爷爷辈的 DNA 链。那么是哪一个子细胞仍然保留干细胞的特性，哪一个子细胞会进行细胞分化呢？

在这里，Rando 利用 " 肌间线蛋白 "（Desmin）来区分两个子细胞。由于要分化为肌肉细胞的那个子细胞会表达肌间线蛋白，而继续保留为干细胞的那个子细胞不会表达肌间线蛋白，看看肌间线蛋白在哪个子细胞中表达，就可以知道哪一个是干细胞，哪一个是要分化的细胞了。

实验结果表明，继承 CIdU 标记的子细胞表达肌间线蛋白，而不继承 CIdU 的 " 子 " 细胞不表达 Desmin，这就清楚地表明继承爷爷辈 DNA 链的子细胞继续为干细胞，而继承父亲辈 DNA 链的子细胞是要进行分化的细胞。

与这一实验差不多同时期，其他科学家又进行了多次类似实验，结果均表明动物组织中的确存在少数不断进行分裂，而又能保留 DNA 链原件的细胞，而且这些细胞还表达干细胞的标记物，或者不表达要分化细胞的标记物（如上述实验中的肌间线蛋白），证明这些细胞确实是干细胞。Cairns 在 1975 年提出的干细胞保留永生 DNA 链的理论，也得到了充分的证明。

毛囊干细胞 DNA 随机分离（左）和非随机分离（右），其中 DAPI、CyA、Lgr5 等均为蛋白质类型，它们都是证明细胞处于不断分裂中的标记物

图片来源：参考文献 16

干细胞是如何保留 DNA 原件的？

在真核细胞中，DNA 被复制时误差率极低，每个碱基对改变的几率大约只有亿分之一，因此新合成的 DNA 链在序列上与原件的相同程度超过 99.999999%。例如小鼠有两份 DNA，每份 DNA 有大约 25 亿碱基对，每次细胞分裂造成的序列变化不过几十个碱基对。小鼠的每份 DNA 被分为 20 条，每条序列的改变就平均只有几个碱基对，小鼠的干细胞是很难从这么小的差别来判断 DNA 的辈分的。此外，在新合成的 DNA 链中，序列改变的位置和情形还是随机的，细胞根本无法预测序列的改变位置和情形，也就无法根据这少量序列的差别来识别 DNA 原件。

不过，细胞可以通过表观遗传修饰来分辨其中 DNA 的辈分。真核细胞中的 DNA 并不是仅有碱基对，而是和组蛋白（histones）结合，组成 " 染色质 "（chromatid）。组蛋白聚合成许多小球，DNA 缠绕于其上。细胞分裂时，染色质高度浓缩，才成为在显微镜下容易看到的 " 染色体 "（chromosome）。所以我们在前面谈到的细胞分裂时 DNA 的分配，其实是分裂期染色体的分配，分配的不仅是 DNA，还有与之结合的组蛋白及其修饰状态。

DNA 的结构，图中小球即为组蛋白，缠绕在组蛋白上的线状物为碱基对，二者平时如同图片右下角一样，为 " 散装 " 毛团状，只是到了细胞分裂时才会聚合在一起形成我们印象中的短棒状 "X" 形染色体

图片来源：wikipedia

组蛋白的修饰方式有多种，包括乙酰化、甲基化和磷酸化。简而言之，就是在组蛋白的氨基酸侧链上加上不同的基团，比如乙酰化是加上乙酰基（CH3CHO-）、甲基化是加上甲基（-CH3）、磷酸化是加上磷酸根等等。不同的基团，其功效不同，让 DNA 启动、停止，或是合成不同的蛋白质——也就是说，这些修饰不改变 DNA 的序列，却影响基因的表达状况，这就是 " 表观遗传修饰 " （epigenetic modifications）。

不同辈分的 DNA 表观遗传修饰的状况不同，就可以成为细胞识别辈分的机制。这有些像人身上穿的衣服。模板 DNA 和新合成的 DNA 就像双胞胎兄弟，彼此极为相似。如果它们再穿同样的衣服（组蛋白），他们之间的差别就极小，几乎无法辨别。但是如果在双胞胎兄弟穿的衣服上做出改变，例如配戴上不同的徽章，就容易区分他们了。组蛋白的修饰就相当于是在衣服上佩戴各种徽章，细胞也就可以识别它们了。

要选择性地分配 DNA（染色体），除了要区分染色体的差别，还要区分纺锤体中的两个中心粒。这样辈分高的 DNA 才 " 知道 " 与哪个中心粒相连，从而进入特定的子细胞。实际的情形也的确如此：细胞分裂时，每个子细胞只接收 1 个中心粒，在下一次细胞分裂前，这个中心粒进行复制，形成两个中心粒，所以两个中心粒的辈分不同，它们所结合蛋白质（例如 Ninein 和 Cenexin）的情形也不同，这样不同的中心粒就可以和不同辈分的染色体相互识别，并分别进入命运不同的子细胞中。

Cairns 当初提出永生 DNA 链的理论时，考虑的主要是 DNA 序列改变与癌症发生率之间的关系，但是随后的科学研究结果表明，干细胞选择性保留的，并不只是 DNA 序列的 " 原始文件 "，还包括与高辈分 DNA 链相联系的组蛋白的表观遗传修饰。它们共同决定了子细胞是继续保持为干细胞还是分化为体细胞。

结语

我们的身体每天要进行大约 2 万亿次细胞分裂。尽管有这么多次的细胞分裂，但是多数人在一生中并不会得癌症，其中一个重要的原因就是干细胞有保留 DNA 原件的本事。

当然这个机制也不能保证我们完全不得癌症。干细胞除了进行不对称分裂，有时也会进行对称分裂，即两个子细胞都是干细胞，以便在需要时增加干细胞的数量，或者在干细胞受损的情况下恢复干细胞的数量。在对称分裂过程中，低辈份的、带有序列变化的 DNA 链就会被保留在一部分干细胞中，因此不是所有的干细胞都能够永远保留 DNA 的原件。

而且除了细胞分裂导致的 DNA 序列变化，身体内部（例如活性氧）和外部（例如紫外线和环境污染）的因素也能够破坏 DNA，造成干细胞 DNA 的序列变化，这是一部分人仍然会得癌症的原因。

但是干细胞保留 DNA 原件的机制，仍然在保护着我们中的大多数人免得癌症，我们也应该感谢生物演化过程创造出来的这个奇迹。